荧光蛋白的应用

原因

为什么我有这么广泛的应用呢？

首先声明一下，荧光蛋白可不只有一种。最为大家熟知的当然是我，绿色荧光蛋白(GFP)，毕竟这可是和诺贝尔化学奖密切相关的。同样在实际中应用的还有我的兄弟红色荧光蛋白(RFP)。先来看一看为什么我能够得到如此广泛的应用。首先，我不挑三拣四，无论将我的基因转移到什么物种中，都能形成发光团；其次，我的发光不依赖于任何辅因子（比如说酶）或其他基质；然后，我相对来说比较稳定，毕竟我有一个“笼子”保护着发光团，因此发光团不大容易受到外界影响；再然后呢，我可是无毒的（这很重要哟），不会影响生理功能，而且易于检测，观测荧光可比其他涉及到具体产物的鉴定的方法简单多了；最后不能不说的一点是，我可是“短小精悍”，仅由238个氨基酸构成，我的表达对细胞的影响很小，这么小的个头也大大方便了科学家将我的基因转移到其他生物中。

尽管我作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点, 但野生型GFP(wtGFP)具有一定的缺点, 如GFP激发峰强度较小, 不易观察;GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大, 表达量较低, 而且在某些植物细胞中并不表达。这些都限制了我进一步的应用, 所以, 一些研究人员运用先进技术对我进行了改进,获得了我的多种突变体, 扩大了我的应用范围。

这时，该我的兄弟红色荧光蛋白(RFP)出场了。它的发现比较晚，1999年才被发现的，足足比我晚了37个年头。其中一种名叫drFP583的红色荧光蛋白发射波长较长，灵敏度与信噪比均比我高。可惜，drFP583有很大缺陷，对细胞有毒性，成熟过程缓慢，而且有寡聚化过程。因此科学家对其进行修饰和改进。Clonetech公司已经将它的一个低毒、低寡聚化、成熟快的一个突变体E57-NA商业化，商品名为DsRed。

2014年诺贝尔化学奖

1873年，显微镜学家Ernst Abbe提出影响传统光学显微镜最大分辨率的一个物理极限：无法小于0.2微米。因为成功突破了这种极限，Eric Betzig, Stefan W. Hell和William E. Moerner被授予2014年的诺贝尔化学奖。由于他们的贡献，我们可以利用光学显微镜对纳米世界一探究竟。

这次获奖的是两项独立的技术。第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射减损（STED）显微技术。此项技术采用了两束激光；一束负责激发荧光分子使其发光，另一束则负责抵消大部分荧光，只留下一块纳米大小体积的荧光区域。用该技术仔细扫描样本，得出的图像分辨率打破了Abbe提出的显微分辨率极限。

Eric Betzig和William Moerner分别独立地进行研究，为第二种技术打下了基础，即单分子显微技术。这种方法依赖于开关单个分子荧光的可能性。科学家对同一区域进行了多次“绘图”，每次仅仅让很少量的分散分子发光。将这些图像叠加起来产生了密集的纳米尺寸超分辨率图像。2006年，Eric Betzig首次采用了这一技术。

开发转基因彩色品种

荧光兔，荧光猪等都已经出现了。是不是感觉它们长得萌萌的？

水生环境检测

研究发现可通过将GFP基因重组到可与水中污染物发生反应的启动子中。这些启动子是源于一些诱导基因:雌激素或异种雌激素诱导的雌激素效应原件基因;编码由应激、重金属或化学毒素诱导的热应激蛋白或金属硫蛋白基因;有致癌物的肿瘤标记基因等。有研究表明，GFP 作为报告基因能够被用来作为转基因有机体连续的定性生物传感器测定水中污染物的水平，并在消除酶或特异性蛋白质试验时，提供快速而有效的结果。

应用

Livet 等用多种不同颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得我们能够观察到大脑的集成线路图，可以直观地看到神经细胞以及细胞间的相互作用。

荧光蛋白还可用于生物发育领域，能够形象的观察生物体的器官组织结构的变化，随着发育学研究的深入，荧光蛋白必将成为强有力的工具。Wan 等发现用GFP 标记斑马鱼的胰脏，可以清楚地观察到胰脏外分泌部位的发育。

真核细胞具有复杂的亚细胞结构，如何定位蛋白在细胞内的出现部位常常是个令人头疼的问题。将GFP的基因与抗病基因融合，生成的融合蛋白具有荧光特性，可以大大方便定位。

一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂多，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助于这一新技术，我们可以更深入地研究其感染方式。

启动子是一段决定基因转录起始与否的特定DNA序列，采用有效的启动子能够提高外源基因的表达水平。传统的启动子活性检测需要特定的底物和检测因子，而且对植物组织或细胞具有破坏性。使用GFP，只要使用荧光显微镜，不会对植物组织或细胞带来破坏。

利用GFP可显色的特点，我们还可对需要的物质进行筛选和纯化。比如增强型GFP(enhanced green fluorescent protein，eGFP)融合蛋白可被荧光激活细胞分选术(FACS)有效地筛选，生产出稳定的人类糖皮质激素受体配体结合域(human glucocorticoid receptor ligand-binding domain, hGRLBD)

GFP具有依赖于pH的荧光变化，因此可以检测活细胞内的pH值。GFP突变体H148Q对不同离子很敏感，可用于检测卤素离子的浓度和传递。GFP还可以检测细胞内电位、氧化还原水平以及在信号传导中作为钙离子指示剂。利用GFP感受器可以检测多种分子(如核酸、激素)的表达状况，甚至可以检测活体细胞中蛋白质的构象变化，其潜在应用前景极为广阔。Taniguchi等构建了一种黄色荧光蛋白融合库(YFP fusion library)作为单分子感受器，可以有效用于分析大肠杆菌单细胞中蛋白质和mRNA表达水平的关系。

GFP分子量较小，能与多种蛋白的N端或C端融合而保持天然蛋白的特性。GFP基因与异源基因可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。Yang等将actin-GFP融合基因转入烟草中，通过荧光显微镜观察膜骨架中融合蛋白的定位及微管的形成。

以往实验人员常常使用抗生素、除草剂基因作为转基因标记，部分科学家担心是否会引发生物安全问题。GFP基因则是一种安全、可靠、省时的标记基因。GFP具有稳定、无毒性、不需要外源底物等优点，比传统的标记基因更具优势。将GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度可以对该基因的表达水平进行检测。

问题与展望

背景噪声问题

如检测植物中GFP基因转化时，如果叶绿体和细胞壁等自发荧光源的背景太强，GFP荧光信号可能被背景信号所遮盖。根和幼胚等在蓝光激发下也能产生黄绿色荧光，但与叶绿体和细胞壁的自发荧光相比，这种自发荧光很弱，可以通过调整光圈减少进光量或选择适合的滤光片消除干扰。

成熟时间长

在细胞生物学的研究过程中发现，新生GFP通过折叠和加工成为具有活性结构的过程十分缓慢。

分子间荧光共振能量转移技术

随着后基因组时代的到来，蛋白质相互作用的重要性已越显突出。鉴定和表征蛋白质相互作用是在分子水平上理解生命运动的前提。分子间荧光共振能量转移技术(FRET)是实时探测蛋白质相互作用的有效方法。